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] ?1年复发NSCL=5)与3年非复发NSCL=5)的HLFNA表达和蛋白水平。转录水平归一化为GAPDH表达，P0.05。
?因此，这些结果表明，低表达HLF的NSCLC细胞具有更强的局部定植和生长能力，以及更强的远处转移能力。
?有很多研究发发现昼夜节律相关因子的失调与NSCLC的复发和转移有关，因此识别出昼夜节律相关因子也是目前临床所需要的。该研究发现，HLF在早期复发的NSCLC组织中显著降低，与NSCLC患者的早期进展与远处转移显著相关。并且上调HLF可抑制肺定植，而沉默HLF可促进体内NSCLC细胞向骨、肝和脑的转移。
?接种细胞6周后，收集小鼠的胫骨、脑、肝组织，并进行H&a;a;E染色处理。如图所示。图3F-I和补充图4G，我们在与载体组相比，过HLF表达小鼠组中，包括骨、大脑和肝脏等远处器官检测到较少的转移性肿瘤，以及较长的累积存活期延长。
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?为了进一步确定HLF在NSCLC细胞局部肺定植和远处转移中的作用，首先在多个不同亚型的NSCLC细胞株中检测了HLF的表达。
?如补充图4A和B所示，与非癌永生化肺支气管上皮细胞BEAS-2B和正常肺成纤维细胞WI-38相比，NSCLC细胞中HLF的NA和蛋白质水平差异下调。我们进一步构建了HLF过表达的NCI-H1975(H1975)和NCI-H520(H520)肺癌细胞，这些细胞表达所有NSCLC细胞系中HLF水平最低，并内源性下调NCI-H460(H460)和NCI-H1299(H1299)细胞HLF的表达，这两种细胞均表达最高的内源性HLF水平(补充图4C和D）。
?然后，采用体内左心室接种小鼠模型检测HLF对NSCLC远处转移能力的影响，将载体NCI-H1975、HLF过表达NCI-H1975、载体NCI-H460和HLFsh#1NCI-H460细胞接种到小鼠左心室。
?在低血清(1%)和低葡萄糖(1gL)培养液组成的低营养条件下，HLF过表达抑制了
?然而，上调HLF抑制NSCLC的生长，而沉默HLF可促进NSCLC细胞的锚定和悬浮生长能力(图4A和B)，表明沉默HLF增强了NSCLC细胞在悬浮条件下的生存能力，即anikis耐药。这是各种癌症中与远处转移有关的转移性癌细胞的主要特征。
?事实上，昼夜节律基因的失调导致了NSCLC的代谢失调，HLF广泛参与了多种物质代谢过程，包括脂质和氧化代谢。
?机制：下调HLF促进非锚定的NSCLC细胞在低营养条件下的无氧代谢，通过PPARα和PPARγ转运、激活NF-κBp65信号通路，基因的缺失和甲基化均有助于下调NSCLC组织中的HLF的表达。HLF有可能成为临床干预NSCLC的新靶点。
?通过分析来自癌症基因组图谱(TCGA)的NSCLC数据集中的多个昼夜相关调控因子和我们之前来自Array表达(AE-ta)的整合RNA表达谱，在目前的研究中，我们辨认出了一个昼夜基因——肝白血病因子(HLF)，它是脯氨酸和富含酸性氨基酸的碱性亮氨酸拉链转录因子家族(PARbZIP)的成员，在早期复发的NSCLC组织中显著减少，这与NSCLC患者的早期进展和远处转移显著相关。
?Kaplan-Meier生存分析进一步显示，与高HLF表达的NSCLC患者相比，低HLF表达的NSCLC患者的无进展生存期更差(图2F)，这与TCGA、AE-ta和K-MPltter分析结果一致(图2G-I)。
?我们之前基于AffytrixU133Plus2.0芯片(AE-ta)结合TCGA分析的NSCLC整合数据谱的结果进一步表明，NSCLC组织中HLF的表达显著下调，并且在早期复发的NSCLC组织中进一步减少（补充图A，B）。
?低表达HLF可能通过营养代谢途径促进NSCLC细胞对低营养状态的适应，因为即使在正常的含氧条件下，癌细胞也更倾向于通过厌氧途径代谢。
?我们利用CCK-8、集落形成和An连接素凋亡进一步研究了HLF在NSCLC中的生物学功能，发现在正常培养条件下，HLF对NSCLC细胞的增殖和凋亡能力没有显著影响(补充图5A–C)。
?采用小鼠尾静脉模型研究NSCLC细胞的肺定植和生长能力。如图3A-D和补充图4E，上调HLF显著抑制H1975细胞在肺中的肿瘤发生，表现为肺结节的形成减少，每的癌细胞数量减少，累积生存率延长。相反，沉默HLF对H460细胞有相反的效果(图3A-C、E和补充图4E)。
图片?Real-tiPCR和Western印迹分析显示，与匹配的ANT相比，710对NSCLC组织中HLF的NA和蛋白水平降低(图1C和D）。
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?不同亚型NSCLC及良性肺疾病组织中HLF免疫组化染色的典型图片（图A）。恶性NSCLC组织和良性肺组织中HLF不同免疫组化染色指数的病例数(良性肺组织，n=64;AD=204;SQ=112;非小细胞肺癌其他亚型，n=26)（图B）。与TCGA(ANT)(ANT、=109、ADC、=511、SQC、=502)相比，ADC和SQC中HLF表达下调（图C）。来自TCGA和AE-ta的NSCLC数据集证明了这一点（D，E）
?最后，与实验结束时相比，在注射HLF稳定过表达的H1975细胞和下调H460细胞的小鼠肿瘤组织中，进一步证实了相应的高和低表达水平(补充图4F)。
?进一步研究发现，在NSCLC患者中，HLF下调与较短的局部无复发生存期和远处无转移生存期呈正相关(补充图3A-D)。同样，低表达HLF的ADC患者以及SQC患者(补充图3I-L)的局部无复发生存期和远处无转移生存期较差(补充图3E-H)。以上结果说明，低表达HLF促进NSCLC早期局部复发和多器官远处转移。
?来自TSA测序数据集，我们发现与相邻正常组织(ANT)相比，NSCLC组织中HLF的表达水平显著降低。通过分析来自TSCLC数据集，与非复发的NSCLC组织3年内未复发，n=72）相比，HLF也是早期复发的NSCLC组织（一年内复发，n=72）中所有昼夜节律相关调节下调因子之一。
?此外，与非复发NSCLC组织相比，早期复发NSCLC组织中HLF表达显著下调（图1E，F）。
【后天或者元旦完结】
?相比之下，沉默HLF可显著增强骨、脑和肝脏转移瘤的形成，并缩短生存期(图3F-I和补充图4H)。
以上结果说明，低表达HLF与NSCLC的晚期临床病理特征和早期进展相关。
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?从名字上说，昼夜节律相关分子由一系列的时钟基因和蛋白质组成，在睡眠周期的调节中发挥着重要作用。越来越多的研究报道，昼夜节律相关调节因子的失调通过不同的机制与肿瘤的发生和转移有关。近年来，生物钟基因在NSCLC中的作用得到了广泛的关注。例如，在肺腺癌中，过表达CRY2、BMAL1和RORA联合下调TIMELESS和NPAS2的表达与预后良好相关，而DEC1和TIMELESS高表达预示着在鳞状细胞NSCLC中较差的总生存率。
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?Westernblt分析配对NSCLC组织中HLF蛋白水平与配对ANT的比较。α-微管蛋白作为负载控制。
NSCLC细胞的增殖，但增加了凋亡潜能，反之亦然（图4C-E）。
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?同样，在低HLF表达的ADC和SQC患者中观察到较短的无进展生存期(图2J-Q)。
?此外，HLF的表达水平随着临床分级和阶段（补充图1G–I）的提高而逐渐下降(补充图1E，F）。
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?综上所述，我们的研究结果表明，低表达HLF与NSCLC患者的早期进展和晚期临床病理特征显著正相关。
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?值得注意的是，HLF表达的改变不仅影响大肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为;50肿瘤细胞)(图3B)，但也影响小肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为5-50个肿瘤细胞)(补充图4E)，这支持了HLF在肿瘤细胞的早期定植和随后的肺内生长中都起着重要作用的观点。
?HLF参与了癌细胞生长培养基的营养代谢，这是HLF抑制NSCLC细胞生长的前提条件。
?我们首先将NSCLC患者分为I级至III级和I级至IV级的不同亚组，如补充图2A-F所示，在相同病理分级下，低表达HLF的NSCLC患者的无进展生存期较高表达HLF的患者短。相应的，根据多个独立数据集，包括我们的样本(补充图2G和H)，TCGA（补充图2I和J），AE-Meta(补充图2K和L)和K-MPltter(补充图2M?O)，在相同临床阶段的NSCLC患者中也有类似的发现。
?我们的结果显示，上调HLF会增加培养液的PH水平，而沉默HLF会降低培养基的pH水平，但正常情况下HLF并不影响NSCLC细胞的表型和数量(补充图5D)。
?虽然多种治疗策略对原发性非小细胞肺癌的治疗具有良好的前景，但由于其早期复发和广泛的转移潜力，非小细胞肺癌仍然是癌症相关死亡的主要原因。
] ?1年复发NSCL=5)与3年非复发NSCL=5)的HLFNA表达和蛋白水平。转录水平归一化为GAPDH表达，P0.05。
?因此，这些结果表明，低表达HLF的NSCLC细胞具有更强的局部定植和生长能力，以及更强的远处转移能力。
?有很多研究发发现昼夜节律相关因子的失调与NSCLC的复发和转移有关，因此识别出昼夜节律相关因子也是目前临床所需要的。该研究发现，HLF在早期复发的NSCLC组织中显著降低，与NSCLC患者的早期进展与远处转移显著相关。并且上调HLF可抑制肺定植，而沉默HLF可促进体内NSCLC细胞向骨、肝和脑的转移。
?接种细胞6周后，收集小鼠的胫骨、脑、肝组织，并进行H&a;a;E染色处理。如图所示。图3F-I和补充图4G，我们在与载体组相比，过HLF表达小鼠组中，包括骨、大脑和肝脏等远处器官检测到较少的转移性肿瘤，以及较长的累积存活期延长。
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?为了进一步确定HLF在NSCLC细胞局部肺定植和远处转移中的作用，首先在多个不同亚型的NSCLC细胞株中检测了HLF的表达。
?如补充图4A和B所示，与非癌永生化肺支气管上皮细胞BEAS-2B和正常肺成纤维细胞WI-38相比，NSCLC细胞中HLF的NA和蛋白质水平差异下调。我们进一步构建了HLF过表达的NCI-H1975(H1975)和NCI-H520(H520)肺癌细胞，这些细胞表达所有NSCLC细胞系中HLF水平最低，并内源性下调NCI-H460(H460)和NCI-H1299(H1299)细胞HLF的表达，这两种细胞均表达最高的内源性HLF水平(补充图4C和D）。
?然后，采用体内左心室接种小鼠模型检测HLF对NSCLC远处转移能力的影响，将载体NCI-H1975、HLF过表达NCI-H1975、载体NCI-H460和HLFsh#1NCI-H460细胞接种到小鼠左心室。
?在低血清(1%)和低葡萄糖(1gL)培养液组成的低营养条件下，HLF过表达抑制了
?然而，上调HLF抑制NSCLC的生长，而沉默HLF可促进NSCLC细胞的锚定和悬浮生长能力(图4A和B)，表明沉默HLF增强了NSCLC细胞在悬浮条件下的生存能力，即anikis耐药。这是各种癌症中与远处转移有关的转移性癌细胞的主要特征。
?事实上，昼夜节律基因的失调导致了NSCLC的代谢失调，HLF广泛参与了多种物质代谢过程，包括脂质和氧化代谢。
?机制：下调HLF促进非锚定的NSCLC细胞在低营养条件下的无氧代谢，通过PPARα和PPARγ转运、激活NF-κBp65信号通路，基因的缺失和甲基化均有助于下调NSCLC组织中的HLF的表达。HLF有可能成为临床干预NSCLC的新靶点。
?通过分析来自癌症基因组图谱(TCGA)的NSCLC数据集中的多个昼夜相关调控因子和我们之前来自Array表达(AE-ta)的整合RNA表达谱，在目前的研究中，我们辨认出了一个昼夜基因——肝白血病因子(HLF)，它是脯氨酸和富含酸性氨基酸的碱性亮氨酸拉链转录因子家族(PARbZIP)的成员，在早期复发的NSCLC组织中显著减少，这与NSCLC患者的早期进展和远处转移显著相关。
?Kaplan-Meier生存分析进一步显示，与高HLF表达的NSCLC患者相比，低HLF表达的NSCLC患者的无进展生存期更差(图2F)，这与TCGA、AE-ta和K-MPltter分析结果一致(图2G-I)。
?我们之前基于AffytrixU133Plus2.0芯片(AE-ta)结合TCGA分析的NSCLC整合数据谱的结果进一步表明，NSCLC组织中HLF的表达显著下调，并且在早期复发的NSCLC组织中进一步减少（补充图A，B）。
?低表达HLF可能通过营养代谢途径促进NSCLC细胞对低营养状态的适应，因为即使在正常的含氧条件下，癌细胞也更倾向于通过厌氧途径代谢。
?我们利用CCK-8、集落形成和An连接素凋亡进一步研究了HLF在NSCLC中的生物学功能，发现在正常培养条件下，HLF对NSCLC细胞的增殖和凋亡能力没有显著影响(补充图5A–C)。
?采用小鼠尾静脉模型研究NSCLC细胞的肺定植和生长能力。如图3A-D和补充图4E，上调HLF显著抑制H1975细胞在肺中的肿瘤发生，表现为肺结节的形成减少，每的癌细胞数量减少，累积生存率延长。相反，沉默HLF对H460细胞有相反的效果(图3A-C、E和补充图4E)。
图片?Real-tiPCR和Western印迹分析显示，与匹配的ANT相比，710对NSCLC组织中HLF的NA和蛋白水平降低(图1C和D）。
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?不同亚型NSCLC及良性肺疾病组织中HLF免疫组化染色的典型图片（图A）。恶性NSCLC组织和良性肺组织中HLF不同免疫组化染色指数的病例数(良性肺组织，n=64;AD=204;SQ=112;非小细胞肺癌其他亚型，n=26)（图B）。与TCGA(ANT)(ANT、=109、ADC、=511、SQC、=502)相比，ADC和SQC中HLF表达下调（图C）。来自TCGA和AE-ta的NSCLC数据集证明了这一点（D，E）
?最后，与实验结束时相比，在注射HLF稳定过表达的H1975细胞和下调H460细胞的小鼠肿瘤组织中，进一步证实了相应的高和低表达水平(补充图4F)。
?进一步研究发现，在NSCLC患者中，HLF下调与较短的局部无复发生存期和远处无转移生存期呈正相关(补充图3A-D)。同样，低表达HLF的ADC患者以及SQC患者(补充图3I-L)的局部无复发生存期和远处无转移生存期较差(补充图3E-H)。以上结果说明，低表达HLF促进NSCLC早期局部复发和多器官远处转移。
?来自TSA测序数据集，我们发现与相邻正常组织(ANT)相比，NSCLC组织中HLF的表达水平显著降低。通过分析来自TSCLC数据集，与非复发的NSCLC组织3年内未复发，n=72）相比，HLF也是早期复发的NSCLC组织（一年内复发，n=72）中所有昼夜节律相关调节下调因子之一。
?此外，与非复发NSCLC组织相比，早期复发NSCLC组织中HLF表达显著下调（图1E，F）。
【后天或者元旦完结】
?相比之下，沉默HLF可显著增强骨、脑和肝脏转移瘤的形成，并缩短生存期(图3F-I和补充图4H)。
以上结果说明，低表达HLF与NSCLC的晚期临床病理特征和早期进展相关。
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?从名字上说，昼夜节律相关分子由一系列的时钟基因和蛋白质组成，在睡眠周期的调节中发挥着重要作用。越来越多的研究报道，昼夜节律相关调节因子的失调通过不同的机制与肿瘤的发生和转移有关。近年来，生物钟基因在NSCLC中的作用得到了广泛的关注。例如，在肺腺癌中，过表达CRY2、BMAL1和RORA联合下调TIMELESS和NPAS2的表达与预后良好相关，而DEC1和TIMELESS高表达预示着在鳞状细胞NSCLC中较差的总生存率。
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?Westernblt分析配对NSCLC组织中HLF蛋白水平与配对ANT的比较。α-微管蛋白作为负载控制。
NSCLC细胞的增殖，但增加了凋亡潜能，反之亦然（图4C-E）。
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?同样，在低HLF表达的ADC和SQC患者中观察到较短的无进展生存期(图2J-Q)。
?此外，HLF的表达水平随着临床分级和阶段（补充图1G–I）的提高而逐渐下降(补充图1E，F）。
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?综上所述，我们的研究结果表明，低表达HLF与NSCLC患者的早期进展和晚期临床病理特征显著正相关。
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?值得注意的是，HLF表达的改变不仅影响大肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为;50肿瘤细胞)(图3B)，但也影响小肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为5-50个肿瘤细胞)(补充图4E)，这支持了HLF在肿瘤细胞的早期定植和随后的肺内生长中都起着重要作用的观点。
?HLF参与了癌细胞生长培养基的营养代谢，这是HLF抑制NSCLC细胞生长的前提条件。
?我们首先将NSCLC患者分为I级至III级和I级至IV级的不同亚组，如补充图2A-F所示，在相同病理分级下，低表达HLF的NSCLC患者的无进展生存期较高表达HLF的患者短。相应的，根据多个独立数据集，包括我们的样本(补充图2G和H)，TCGA（补充图2I和J），AE-Meta(补充图2K和L)和K-MPltter(补充图2M?O)，在相同临床阶段的NSCLC患者中也有类似的发现。
?我们的结果显示，上调HLF会增加培养液的PH水平，而沉默HLF会降低培养基的pH水平，但正常情况下HLF并不影响NSCLC细胞的表型和数量(补充图5D)。
?虽然多种治疗策略对原发性非小细胞肺癌的治疗具有良好的前景，但由于其早期复发和广泛的转移潜力，非小细胞肺癌仍然是癌症相关死亡的主要原因。
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